пожалуйста помогите!!
Единица (U) фермента Xase определяется как оборот 1 мкмоль X в одну минуту. Продукт Y имеет коэффициент экстинкции 3800 М-1 см-1. Вы используете 10 мкл раствора фермента для реакции в объеме 500 мкл. Через 40 минут остановите реакцию и измерьте оптическую плотность 0,5 (d=1).
а) Рассчитайте концентрацию продукта, количество продукта, среднюю скорость оборота, количество фермента и концентрацию фермента (в ед./мл) исходного раствора.
б) фермент имеет значение KM 50 мкМ. Равновесие реакции находится на стороне Y, аллостерическая регуляция отсутствует. Начальная концентрация X в вашей реакции была 200 мкМ. Допустим ли расчет концентрации фермента в данных условиях?
в) Верен ли расчет концентрации фермента, если начальная концентрация X была 2 мМ?
Ответы
а) Для расчета количества продукта необходимо знать, сколько моляров продукта образуется на один оборот фермента, что можно определить с помощью коэффициента экстинкции и закона Бугера-Ламберта:
A = εlc
где A - оптическая плотность, ε - коэффициент экстинкции, l - длина кюветы, c - концентрация продукта.
Длину кюветы примем равной 1 см (т.к. коэффициент экстинкции дан в см^-1).
Тогда концентрация продукта Y:
c = A/εl = 0.5 / (3800 М^-1 см^-1 * 1 см) = 1.3 * 10^-4 М
Объем реакционной смеси равен 500 мкл, поэтому количество продукта:
n = cV = 1.3 * 10^-4 М * 500 * 10^-6 л = 6.5 * 10^-8 моль
Средняя скорость оборота фермента:
v = n/t = 6.5 * 10^-8 моль / 40 мин * 60 с/мин = 2.17 * 10^-10 моль/с
Количество фермента:
n(фермента) = U * V = (-ln(1-D)) * V = (-ln(1-0.5)) * 10 мкл = 6.93 мкмоль
Концентрация фермента в единицах/мл:
C(фермента) = n(фермента) / V(реакции) = 6.93 мкмоль / 10 мл = 0.693 ед./мл
б)
Для расчета концентрации фермента необходимо знать значения коэффициента скорости реакции при различных концентрациях субстрата, чтобы построить график Линевера-Берка и определить константу Михаэлиса (Km) и максимальную скорость реакции (Vmax). Однако, в данном случае таких данных нет, поэтому допустимость расчета концентрации фермента нельзя оценить.
в)
Нет, расчет концентрации фермента будет неверным, так как начальная концентрация X в 2 мМ выше, чем значение KM для фермента Xase (50 мкМ), что означает, что концентрация свободного фермента будет значительно меньше, чем исходный раствор. При такой высокой концентрации субстрата большая часть фермента будет занята в реакции, и не будет доступна для новых циклов катализа. Поэтому для правильного расчета концентрации фермента в таких условиях необходимо использовать моделирование реакции, учитывающее изменение концентрации субстрата во времени.